细胞培养操作步骤
从试剂准备到细胞复苏，标准化操作全流程指南，助力细胞培养实验高效开展
00
操作总览
试剂准备
PBS / 胰酶 / 培养基
细胞换液
维持营养供应
细胞传代
80-90%汇合时操作
细胞冻存
对数生长期保种
细胞复苏
37℃快速解冻
1000 rpm
标准离心转速
5 min
标准离心时间
37℃
培养/复苏温度
80-90%
传代汇合度
01
试剂准备
开展细胞培养实验前，需提前准备好以下核心试剂，所有试剂使用前应预热至37℃（冻存液除外）。
| 试剂名称 | 推荐货号 | 用途 |
|---|---|---|
| 1×PBS 磷酸盐缓冲液 | SJ094 | 润洗细胞，去除残留血清 |
| 0.25% 胰酶消化液 （含0.02% EDTA，不含酚红） | FH20221111 | 贴壁细胞消化脱壁 |
| 完全培养基 | 丰晖配套 | 细胞培养与维持 |
| 细胞冻存液 | 丰晖配套 | 细胞低温保存 |
⚠️ 注意：悬浮细胞培养不需要胰酶消化液。所有试剂使用前检查是否澄清无沉淀，过期或浑浊试剂请勿使用。
02
细胞换液
细胞培养过程中需要定期换液来维持细胞的营养，一般2~3天更换一次。不同细胞类型的换液操作有所不同：
贴壁细胞
将细胞培养上清液小心吸出，加入适量预热的完全培养基即可。操作时枪头贴壁对侧缓慢加入，避免直接冲击细胞层。
半贴壁细胞
收集细胞培养上清及所有悬浮细胞 → 1000 rpm 离心 5 min → 弃上清 → 加入适量预热的完全培养基重悬 → 接种至原培养容器中。
悬浮细胞
用移液枪轻轻吹打细胞层，将细胞和上清全部收集 → 1000 rpm 离心 5 min → 弃上清 → 加入适量预热的完全培养基重悬 → 接种至原培养容器中继续培养。
💡 悬浮细胞也可以半量换液：吸出一半旧培养基，补充等量新鲜培养基，操作更简便，对细胞干扰更小。
03
细胞传代
通常当细胞汇合率达到 80%~90% 时，需进行传代处理。传代比例一般为 1:2。
贴壁细胞
- 弃去细胞培养上清，用PBS润洗 1~2次
- 加入 1~2 ml 胰酶（T25瓶），使胰酶覆盖整个瓶底细胞，盖好放入培养箱消化
- 细胞消化 0.5~2 min（具体时间根据镜下形态判断，难消化细胞可适当延长）。显微镜下观察，细胞回缩、即将脱壁而未脱壁时，加入 3~5 倍消化液体积的完全培养基终止消化⚠️ 注意：消化过度会严重影响细胞存活率，务必密切观察镜下形态。可用枪轻轻吹打确认细胞是否已脱壁。
- 将细胞混悬液收集到离心管中，1000 rpm 离心 5 min，弃上清
- 用 1~2 ml 新鲜完全培养基重悬细胞，按 1:2 接种至 2 个 T25 瓶中，补加适量培养基至 6~8 ml
悬浮细胞
- 用移液枪轻轻吹打细胞层，将细胞和上清全部收集，1000 rpm 离心 5 min，弃上清
- 用 1~2 ml 新鲜完全培养基重悬细胞，按 1:2 接种至 2 个 T25 瓶中，补加适量培养基至 6~8 ml
04
细胞冻存
当细胞生长状态良好时，可进行冻存保种。理想冻存时机为细胞处于对数生长期。
🔍 判断标准：细胞汇合度 60~80%，细胞折光度好，培养基澄清，碎片较少，无黑色晶体物质。
- 弃去细胞培养上清，用PBS润洗 1~2次，加入 1~2 ml 胰酶（T25瓶），盖好放入培养箱消化 0.5~2 min
- 将细胞混悬液收集到离心管中（悬浮细胞直接收集即可），1000 rpm 离心 5 min，弃上清
- 加入适量预冷的细胞冻存液（含血清冻存液建议现配现用），立即混匀，转入冻存管。冻存密度 1~10×10⁶ 个/ml
- 旋紧管盖，在管壁标注 细胞名称、代数、冻存日期
- 按梯度降温程序转移冻存管
4℃
预冷 30 min
→
-20℃
冷冻 4 h
→
-80℃
过夜（≤24h）
→
液氮
长期保存
🧊 程序降温盒方案：如有程序降温盒，可将冻存管放入提前预冷的程序降温盒，直接放入 -80℃ 冰箱，24 小时后转入液氮罐储存。
⚠️ 重要提醒：细胞不可长期保存在 -80℃ 冰箱中，建议 24 小时内尽快转移至液氮长期保存。
05
细胞复苏
复苏前准备
- 打开恒温水浴锅，将水温调至 37℃
- 在超净工作台内提前准备 15 ml 离心管，加入 4~5 ml 预热的完全培养基
复苏操作
- 将冻存管从干冰/-80℃冰箱/液氮罐中取出后，立即放入 37℃ 水浴锅中，快速摇晃使细胞在 1~2 min 内迅速解冻。注意管口连接处避免碰到水
- 将冻存管壁的水擦干，酒精消毒后放入超净工作台，小心开盖，用移液枪将细胞和冻存液轻轻吹打混匀，转移至预先准备好的含培养基的 15 ml 离心管中
- 1000 rpm 离心 5 min，弃上清，加 1~2 ml 新鲜完全培养基轻柔吹散混匀，将细胞悬液均匀接种至 T25 瓶中，补加适量培养基
- 复苏后第二天观察细胞状态并换液
💡 贴壁/半贴壁细胞注意：接种后 24h 内尽量不操作。特殊细胞贴壁较慢，复苏后 48h 内不要操作，以确保细胞充分贴壁。
06
关键参数速查
| 操作环节 | 关键参数 | 说明 |
|---|---|---|
| 离心 | 1000 rpm / 5 min | 换液、传代、冻存、复苏通用 |
| 换液频率 | 2~3 天/次 | 维持细胞营养 |
| 传代时机 | 汇合度 80~90% | 细胞尚未完全铺满时最佳 |
| 消化时间 | 0.5~2 min | 镜下观察细胞回缩即终止 |
| 冻存密度 | 1~10×10⁶ 个/ml | 对数生长期细胞冻存 |
| 复苏水温 | 37℃ | 1~2 min 内完全解冻 |
| 冻存梯度 | 4℃→-20℃→-80℃→液氮 | 30min → 4h → 过夜 → 长期 |
| 传代比例 | 1:2 | T25瓶补液至 6~8 ml |
