PCR 引入点突变、插入或缺失，DpnI 去除野生模板，全长测序核验确保仅目标位点突变
定点突变是通过 PCR 向目的片段中引入所需变化的技术，包括碱基的增加、删除、点突变等，能高效改造目的蛋白的理化特性与生物学功能，是研究蛋白质结构与功能关系的有力工具。 丰晖生物提供一站式基因定点突变服务，涵盖单点、多点、插入、缺失以及长片段、多位点分步突变，全流程标准化操作，原始数据与完整报告同时交付，确保数据真实可靠。 核心应用场景： 提示：请提供经测序正确、含原始序列的模板质粒或菌液，并明确突变目标序列信息。若序列含重复结构、发夹结构或高 GC 区域，突变难度上升，方案会作相应调整。 利用 PCR 进行定点突变的关键是合成一对特殊的引物：除与目标 DNA 模板互补外，引物中间还含有所需的突变碱基。引物长度通常在 25–45 个核苷酸之间，以保证突变位点两侧有足够的序列与模板正确配对，确保 PCR 的效率与特异性。 退火时突变引物与模板的互补序列结合，引物中央的错配碱基在合适条件下仍能配对。随后 DNA 聚合酶自引物 3' 端开始延伸，将携带的突变碱基复制到新合成的 DNA 链中，经过多轮「变性–退火–延伸」循环，含突变位点的片段被指数级扩增。 从大肠杆菌等常见宿主中提取的质粒 DNA 是甲基化的，而体外 PCR 扩增出的新 DNA 非甲基化。DpnI 可特异性识别并切割甲基化 DNA，因而只切割原始模板而不影响新合成的突变 DNA，从而去除野生模板。DpnI 处理后，将 PCR 产物与载体重组或进行环化并转化感受态细胞，最后通过测序对菌落进行鉴定，确认突变是否正确引入。 常规按 20 bp 以内的改动计为 1 个突变位点。多点突变或多位点分步突变可通过一次或多次 PCR 完成，具体方案依据位点间距与序列特点确定。 单点、多点、插入、缺失均可实现，长片段与多位点分步突变成功率高 采用高保真聚合酶扩增，搭配 DpnI 充分去除野生模板，野生背景极低 菌液 PCR 初筛结合全长测序核验，确保仅目标位点突变、无多余错配 载体储备丰富，突变完成后可衔接亚克隆、病毒包装与细胞实验 发货前经 QC 审核，测序覆盖基因全长及上下游载体骨架 确认突变类型与位点，设计含突变碱基的引物 高保真聚合酶扩增，将突变碱基引入新链 去除甲基化的原始模板，降低野生背景 重组或环化后转化感受态细胞，菌液 PCR 初筛 Sanger 测序覆盖全长及载体骨架，制备质粒与菌液 下表为本项服务的常规工作环节与说明。样品状态、片段长度与突变方案确认后，我们会给出明确的时间安排。 若序列含重复结构、发夹结构或高 GC 区域，突变难度增大，我们会先做可行性评估并调整方案。 以下为基因点突变并构建表达载体的典型结果示例。 图一 对 FASN（NM_004104）基因进行 K1241A 点突变并构建于 pcDNA3.1-3xFlag-C 载体 案例说明：对 FASN（NM_004104）基因进行 K1241A 点突变，突变后的基因构建于 pcDNA3.1-3xFlag-C 载体，经全长测序确认仅目标位点发生突变。 定点突变对序列信息与模板质量要求较高，请注意以下事项： 可引入碱基的点突变、插入与缺失，涵盖单点、多点以及长片段、多位点分步突变。具体方案依据突变位点间距与序列结构确定。 请提供经测序正确、含原始序列的模板质粒或菌液，并提供突变目标序列信息（如位点、突变形式与两侧序列），便于设计突变引物。 从大肠杆菌提取的模板质粒是甲基化的，而 PCR 新合成的链非甲基化。DpnI 只切割甲基化的原始模板，可在转化前去除野生模板，显著降低野生背景。 我们通过菌液 PCR 初筛后挑取单克隆进行 Sanger 测序，测序覆盖基因全长及上下游不少于 50 bp 的载体骨架，确认仅目标位点发生突变、无多余错配。 位点间距较近时可尝试一次 PCR 引入多个位点；位点分散或序列复杂时建议分步突变，以降低失败风险。我们会根据序列特点给出方案。 具体周期与片段长度、突变个数及序列复杂度有关。样品与突变方案确认后，我们会给出明确的时间安排。01实验简介
02实验原理
突变位点的计数口径
03技术优势
突变类型全覆盖
扩增保真度高
多重质控验证
自有载体资源
交付质控严格
04实验流程
1突变方案设计
2PCR 扩增
3DpnI 消化
4转化与初筛
5测序验证与交付
05服务内容
服务内容 工作说明 突变方案与引物设计 确认突变类型、位点与序列可行性 PCR 扩增与 DpnI 消化 高保真扩增引入突变，DpnI 去除野生模板 转化筛选与菌液 PCR 初筛 转化感受态细胞并挑取单克隆初筛 测序验证与报告出具 全长测序核验序列并出具完整报告 06交付标准
交付内容 说明 液体质粒 默认 20μl，浓度大于 200 ng/μl，未去内毒素，不可直接转染细胞 甘油菌液 默认 300μl，附抗性信息，便于后续扩增与保存 质粒图谱与测序文件 提供质粒图谱与测序文件，覆盖基因全长及上下游不少于 50 bp 的载体骨架 空载对照 随附空载对照质粒，便于后续表达对照实验 完整实验报告 含突变方案、引物信息、DpnI 处理及测序鉴定结果 07案例展示
08注意事项
1提供合格模板与突变信息 — 请提供经测序正确、含原始序列的模板质粒或菌液，并给出突变目标序列信息（位点、突变类型与前后序列）。2复杂结构需评估 — 若序列含重复结构、发夹结构或高 GC 含量，定点突变难度上升，方案与工作量会作相应调整，建议先做可行性评估。3测序覆盖范围 — 构建完成后先挑取单克隆进行 Sanger 测序，结果覆盖基因全长及上下游不少于 50 bp 的载体骨架，确保基因正确且克隆在指定位置。4突变位点计数 — 常规按 20 bp 以内的改动计为 1 个突变位点；多点突变可分步完成。5发货前 QC 审核 — 最终发货前经严格 QC 审核，确认序列与规格后方可交付。6默认质粒不可直接转染 — 默认质粒未去内毒素，如需转染或蛋白表达，请下单时说明，我们可提供高规格质粒抽提。09常见问题
可以实现哪些类型的突变？
需要提供什么材料？
为什么要用 DpnI 处理？
如何确认突变成功？
多点突变能一次完成吗？
突变周期多长？
10相关服务
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长沙市岳麓区麓云路100号
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