CRISPR/Cas9 RNP 法敲除常见细胞系，PCR 与测序鉴定，交付 KO 稳株
基因敲除稳株是利用 CRISPR/Cas9 技术，通过 RNP（核糖核蛋白复合物）法针对常见细胞系进行基因敲除改造的服务。CRISPR/Cas9 敲除细胞系广泛应用于肿瘤相关基因研究、遗传疾病治疗、动植物转化研究等领域。
RNP 法将 Cas9 蛋白与 sgRNA 在体外组装成复合物后直接导入细胞，作用完成后迅速降解，脱靶风险低、细胞毒性小，较质粒法更适合对基因组稳定性要求较高的稳株构建。
丰晖生物提供一站式基因敲除稳株构建服务：从靶点评估、sgRNA 设计、细胞转染、单克隆筛选到基因组与蛋白水平鉴定全流程标准化操作，原始数据与完整实验报告同步交付。
核心应用场景：
提示：靶基因是否为敲除致死基因、细胞是否具备克隆形成能力与传代能力，是决定敲除稳株能否构建成功的关键前提，建议在方案设计阶段一并评估。
CRISPR（成簇的规律间隔短回文重复序列）系统是由重复序列及其相关蛋白（如 Cas9）组成的基因组防御机制，能够识别并切割入侵的外源 DNA，保护细胞免受病毒与噬菌体侵害。
Cas9 蛋白是一种核酸酶，能够在 sgRNA 的引导下识别并结合目标 DNA 序列。sgRNA 由 tracrRNA 与 crRNA 组成，通过识别靶位点旁的 PAM 序列定位到目标区域。
Cas9 在 PAM 序列附近切割双链 DNA，形成双链断裂（DSB），细胞内随即启动 NHEJ 或 HDR 修复通路。NHEJ 修复通常引入插入或缺失（Indel），可造成移码从而实现基因敲除；若提供供体模板，HDR 修复则可用于基因敲入或替换。
Cas9 对靶位点 DNA 双链进行切割产生 DSB，绝大多数情况下（>80%）细胞采用 NHEJ 修复，使靶位点随机产生个别碱基的删除或插入（Indel）。当 Indel 位于编码区且长度非 3 的倍数时，会造成移码从而获得基因敲除模型；该方法不适用于非编码基因的敲除。
采用两条 sgRNA 将特定的外显子片段全部删除，敲除效果更明确、筛选鉴定更简单，对非编码基因也有良好的敲除效果。
千余种不同种属细胞系与原代细胞一站式可选
细胞 / 分子 / 病毒平台配套，个性化敲除方案专属定制
自建基因编辑功能细胞库持续扩充，现货即用
低脱靶、高敲除效率，实验数据稳定可靠
快速筛选型、标准精准型与双重保障型按需选择
评估基因是否为敲除致死基因、细胞克隆形成与传代能力，确定敲除策略
设计并筛选高特异性 sgRNA，按单 sgRNA 或双 sgRNA 策略准备
体外组装 Cas9-sgRNA 核糖核蛋白复合物并导入目标细胞
抗性加压筛选后有限稀释铺板，分离并扩增单克隆细胞
提取克隆基因组 DNA，经 PCR 扩增与 Sanger 测序鉴定基因型
扩增阳性克隆，完成 STR/种属鉴定与支原体检测后冻存交付
下表为本项服务的常规工作环节与说明。细胞与方案确认后，我们会给出明确的时间安排。
| 服务内容 | 工作说明 |
|---|---|
| 细胞准备与靶点评估 | 细胞状态确认、敲除致死性与克隆形成能力评估 |
| sgRNA 设计与 RNP 转染 | 高特异性 sgRNA 设计筛选与核糖核蛋白复合物导入 |
| 抗性筛选与单克隆分离 | 药物加压筛选、有限稀释铺板与克隆扩增 |
| 基因组水平鉴定 | 基因组 PCR 与 Sanger 测序确认敲除基因型 |
| 蛋白水平鉴定与交付 | 按方案完成 Western blot 检测，细胞扩增后冻存交付 |
三档方案的差异在于筛选深度：快速筛选型交付多克隆 KO 株，标准精准型交付基因层面 100% 敲除的单克隆 KO 株，双重保障型在此基础上增加蛋白层面敲除 / 敲低的 Western blot 检测报告。
| 交付内容 | 说明 |
|---|---|
| 快速筛选型（多克隆 KO 株） | 亲本细胞 + 敲除细胞（各 1×10⁶）、细胞说明书、STR/种属报告、支原体检测报告、基因组 PCR + Sanger 测序报告；多克隆 KO 株可由客户后续自行筛选单克隆 |
| 标准精准型（单克隆 KO 株） | 在快速筛选型交付物基础上，交付基因层面 100% 敲除的单克隆 KO 株 |
| 双重保障型（单克隆 KO 株） | 在标准精准型交付物基础上，增加 Western blot 检测报告，保障基因层面敲除与蛋白层面敲除 / 敲低 |
| 亲本细胞 | 随单赠送 1×10⁶，冻存或复苏形式，用于后续对照实验 |
| 敲除细胞 | 冻存或复苏形式，1×10⁶，附细胞说明书与鉴定报告 |
以下为已交付的基因敲除稳株典型结果示例。
结果呈现说明：基因组水平以 PCR 扩增片段大小与 Sanger 测序峰图比对判定基因型，标准精准型与双重保障型均以基因层面 100% 敲除为标准；双重保障型同时提供 Western blot 条带与灰度分析结果。
影响敲除稳株构建成败的因素较多，方案设计阶段需重点评估以下几类。
敲除稳株在基因组水平直接破坏靶基因，蛋白表达彻底缺失，结果更明确，但成本与筛选难度更高；干扰稳株在转录后水平降低表达，可获得部分敲低效果，构建相对简便。可根据研究目的与经费选择。
若靶基因为敲除致死基因，其缺失会导致细胞无法存活，或该细胞不具备克隆形成与传代能力，均无法获得敲除稳株。建议在方案设计阶段先完成致死性与细胞特性评估。
快速筛选型交付多克隆 KO 株，可由客户后续自行筛选单克隆，适合初筛；标准精准型交付基因层面 100% 敲除的单克隆 KO 株；双重保障型在基因敲除基础上增加 Western blot 检测，保障蛋白层面的敲除 / 敲低效果。
基因组水平通过 PCR 扩增与 Sanger 测序确认突变类型与基因型；标准精准型与双重保障型以基因层面 100% 敲除为标准，双重保障型另提供 Western blot 蛋白水平检测报告。
常见原因包括移码不完全导致残留部分功能蛋白、mRNA 逃逸 NMD 翻译出截短蛋白、同源基因代偿，以及翻译后修饰维持部分功能等；癌细胞的多拷贝基因组也可能造成类似现象，建议结合多水平验证判读。
敲除细胞与亲本细胞均以冻存或复苏形式交付，数量均为 1×10⁶，并随附细胞说明书与鉴定报告。
具体周期视细胞类型、敲除策略与单克隆筛选难度而定，方案确认后我们会给出明确的时间安排。
敲除稳株常与载体构建、过表达 / 干扰稳株及细胞鉴定配套开展，以下服务可组合：
service@fenghbio.com
长沙市岳麓区麓云路100号
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