shRNA Target Screening

shRNA筛靶套餐

设计 3~5 条 shRNA,qPCR 逐条验证敲降效率,择优锁定高效干扰序列

shRNA 筛靶
三保一设计
qPCR 验证
敲降效率

shRNA(短发夹 RNA)是一段含反向互补序列、中间以环结构相连的双链 RNA,导入细胞后经 Dicer 酶切割为 siRNA,介导靶基因 mRNA 降解,实现基因沉默。针对不同靶点设计的 shRNA 敲降效果差异较大,因此开展 RNA 干扰实验前应先筛选有效序列。

常规做法是设计 3~5 条 shRNA,在目的细胞中逐条验证敲降效率,择优选取 1~2 条干扰效率最高的序列开展后续实验,可显著提高 RNA 干扰结果的可靠性。

丰晖生物提供一站式 shRNA 筛靶套餐服务:从序列设计、载体构建、细胞转染到 qPCR 检测全流程标准化操作,原始数据与完整实验报告同步交付,确保数据真实可靠。

核心应用场景:

  • 干扰序列筛选 — 从多条 shRNA 中筛出敲降效率最高的序列用于后续实验
  • 基因功能研究 — 获得高效干扰条件后开展表型与通路研究
  • 稳株构建前置 — 为干扰稳株构建锁定高效 shRNA 序列
  • 论文数据支撑 — 提供 qPCR 原始数据与敲降效率验证结果

提示:筛靶需要在目的细胞中进行,才能反映真实的敲降效率。若目的细胞难转染或培养困难,可先用工具细胞初筛,再在目的细胞中复核,具体方案会在实验设计阶段一并确认。

shRNA 干扰载体转染宿主细胞后进入细胞核,在 RNA 聚合酶 Ⅲ 作用下转录出 shRNA 并转运至细胞质;Dicer 酶将 shRNA 剪切为 siRNA 双链,双链组装入 RISC 复合体后解旋,正义链被降解,仅反义引导链留存形成活化 RISC。

活化 RISC 依靠引导链特异性识别并结合靶 mRNA,激活 AGO2 蛋白切割降解靶 mRNA,完成转录后基因沉默;反义引导链可循环发挥作用,持续降解多条靶 mRNA。

由于 shRNA 序列与靶位点的匹配程度、mRNA 二级结构及脱靶情况直接影响沉默效果,同一致靶基因的不同 shRNA 敲降效率可相差数倍,因此需要通过 qPCR 逐条实测筛选。


图1 shRNA 介导基因沉默与筛靶验证原理示意图

🎯

多序列并行筛选

一次设计 3~5 条 shRNA 并逐条验证,快速锁定高效敲降序列

🔬

qPCR 定量敲降效率

以 qPCR 定量 mRNA 水平变化,敲降效率数据客观可比

⚡

目的细胞或工具细胞可选

可在目的细胞直接筛靶,也可先用工具细胞初筛再复核

📊

原始数据完整可追溯

交付 qPCR 原始数据、扩增曲线与溶解曲线,结果可复核

🧪

衔接后续实验

筛得的序列可直接用于干扰稳株构建或后续功能研究

1

序列设计与载体构建

针对靶基因不同区域设计 3~5 条 shRNA,构建干扰载体并测序验证

2

qPCR 引物设计与验证

针对靶基因设计 qPCR 引物,验证引物扩增效率与特异性

3

细胞培养与转染

培养目的细胞或工具细胞,按分组转染 shRNA 载体与阴性对照

4

本底检测与 qPCR

检测目的基因本底表达水平,转染后收取细胞进行 qPCR 检测

5

敲降效率分析与报告

计算各条 shRNA 的相对敲降效率,排序列出并出具完整报告

下表为本项服务的常规工作环节与说明。样品与实验方案确认后,我们会给出明确的时间安排。

服务内容工作说明
shRNA 序列设计与载体构建针对靶基因不同区域设计 3~5 条 shRNA 并构建干扰载体
qPCR 引物设计与验证针对待测序列设计引物,验证扩增效率与特异性
细胞培养与转染可选工具细胞或目的细胞,按分组完成转染
预实验qPCR 引物验证及目的基因本底表达水平检测
qPCR 检测与数据分析每个反应默认 3 个复孔,计算敲降效率并进行统计分析

报告会明确列出各条 shRNA 的相对敲降效率并排序,便于据此选择后续实验序列。

交付内容说明
完整实验报告含所用试剂耗材、仪器设备、操作步骤、原始数据与实验分析结果
qPCR 原始数据含扩增曲线、溶解曲线与逐孔 Ct 值,可导入软件复分析
敲降效率结果各条 shRNA 的相对表达量与敲降效率百分比及排序
引物信息qPCR 引物序列、扩增片段信息与验证结果
剩余样本与试剂未消耗完的样本与试剂按要求返回

以下为针对小鼠 Yap65 基因设计 3 条 shRNA,并在 C26 小鼠结肠癌细胞中验证敲降效率的结果示例。

图一 C26 细胞中 3 条 Yap65 shRNA 的敲降效率验证结果

结果呈现说明:以阴性对照为基准计算相对表达量,敲降效率 =(1 − 实验组相对表达量)× 100%。报告同时给出各条序列的复孔数据与统计学检验结果。

客户可自行寄送样本进行实验,也可选择由我方提供细胞。样本寄送要求如下:

1
复苏细胞 — T25 方瓶常温寄送,运输途中避免剧烈震荡。
2
冻存细胞 — 干冰寄送,保证干冰充足,避免运输过程中反复冻融。
3
质粒、miRNA 等 — 冰袋寄送,避免高温与反复冻融。
4
细胞信息 — 随样提供细胞名称、培养条件、鉴定报告与支原体阴性报告,便于我方复检与培养。
5
目的细胞与工具细胞 — 建议在目的细胞中直接筛靶;若目的细胞难转染,可先用工具细胞初筛再在目的细胞中复核。
6
分组信息 — 明确 shRNA 条数、阴性对照设置与复孔要求,方案确认后按分组开展实验。
7
样本量 — 每个检测组建议预留足量样本,避免因样本不足导致复孔缺失而影响统计。

Q为什么干扰前要先筛靶?

针对靶基因不同区域设计的 shRNA 敲降效率差异较大,直接选定单一序列存在无效风险。先设计 3~5 条并逐条实测,择优选取 1~2 条高效序列,可显著提高后续干扰实验的成功率。

Q筛靶需要在什么细胞中做?

建议在目的细胞中进行,才能反映真实的敲降效率。若目的细胞难转染或培养困难,可先用工具细胞初筛,再在目的细胞中复核。

Q用 qPCR 还是 Western blot 判断敲降效率?

常规以 qPCR 检测 mRNA 水平作为筛选依据,效率高、成本低;若研究关注蛋白水平,可在筛得高效序列后追加 Western blot 验证。

Q三保一和筛靶套餐有什么区别?

三保一是在序列设计层面针对不同区域设计三条 shRNA 以提高命中率;筛靶套餐在序列设计之外还包含转染与 qPCR 检测,直接给出各条序列的实测敲降效率。

Q敲降效率多少算合格?

通常认为相对敲降效率达到 70% 以上即为较好结果;具体判定阈值可结合目的基因本底表达水平与研究需求确定。

Q可以自己寄细胞或质粒吗?

可以。复苏细胞建议 T25 方瓶常温寄送,冻存细胞需干冰寄送,质粒等请使用冰袋;同时请提供细胞说明书与培养条件,便于我方复检。

Q实验周期多长?

具体周期视 shRNA 条数、细胞状态与 qPCR 排期而定,方案确认后我们会给出明确的时间安排。

需要 shRNA 筛靶套餐服务?

提供靶基因与细胞信息,技术团队设计多条 shRNA 并逐条 qPCR 验证敲降效率,交付原始数据与完整实验报告

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