SYBR Green 与 TaqMan 双方案，含引物探针设计、标准曲线定量与熔解曲线质控
实时荧光定量 PCR（qPCR）是指在 PCR 反应体系中加入可与 DNA 产物特异性结合的荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程，最终定量各个样本的表达情况。qPCR 检测常用两种方法：SYBR Green 染料法和 TaqMan 探针法。
qPCR 兼具高灵敏度、宽动态范围与良好的重复性，是基因表达定量、病原检测与突变分析等研究的常规手段。
丰晖生物提供一站式 qPCR 服务，从引物与探针设计、RNA 提取与反转录、标准曲线制作到上机检测与数据分析全程标准化操作，原始数据与完整报告同步交付。
核心应用场景：
提示：结果判读需关注熔解曲线与扩增曲线：理想熔解曲线应为单一尖锐峰，扩增曲线应呈典型 S 型；平行复孔间 Ct 值标准差建议小于 0.5，绝对定量时标准曲线相关系数（R²）应大于 0.99。
qPCR（实时荧光定量 PCR）的核心，是在传统 PCR 基础上加入荧光标记，通过实时监测荧光信号的累积来计算目标序列的量。常用的两种方法是 SYBR Green 染料法和 TaqMan 探针法。
SYBR Green 染料法：SYBR Green 是一种非对称菁类染料，游离于溶液中时分子内部存在剧烈的旋转运动，吸收的光能主要以热能形式散发，荧光本底极低。当 PCR 延伸生成双链 DNA 后，SYBR Green 嵌入 DNA 双螺旋的小沟或静电结合于磷酸骨架，分子构象被固定、旋转运动受限，激发态能量转向荧光发射，荧光量子产率急剧升高。仪器通常在延伸阶段结束时采集荧光，此时管内的荧光强度（Rn 值）直接反映该时刻的双链 DNA 总量。但 SYBR Green 会结合任何双链（包括非特异性产物和引物二聚体），因此必须通过熔解曲线确认扩增产物的唯一性。
TaqMan 探针法：其核心是荧光共振能量转移（FRET）和 Taq 酶固有的 5'→3' 外切酶活性。探针是与模板特异性互补的短寡核苷酸，5' 端标记报告荧光基团（如 FAM），3' 端标记淬灭基团（如 BHQ 或 TAMRA），且 3' 端经化学修饰完全封闭，无法作为引物延伸。探针完整游离时报告基团与淬灭基团空间距离极近，报告基团受激发后的能量通过偶极-偶极相互作用非辐射地转移给淬灭基团，检测不到信号。当探针与模板 DNA 互补杂交后，Taq 聚合酶遇到下游与模板结合的探针时，其 5'→3' 外切核酸酶活性被激活，逐个切除探针 5' 端的核苷酸，将报告基团与淬灭基团彻底分离，此时 FRET 效应消失，报告基团发出不可逆的稳定荧光。因此每合成一条新 DNA 链只切割一个探针分子、释放一个单位的荧光信号，荧光信号的累积量严格等于新合成的目标扩增子数量，几乎不存在背景干扰。
SYBR Green 染料法通用性强、成本较低，适合常规表达定量，但对扩增特异性依赖熔解曲线确认；TaqMan 探针法特异性更高、可多重检测，适合低丰度靶标与高特异性要求的场景，但需针对靶序列合成专用探针。可根据研究目的与预算选择。
SYBR Green 染料法与 TaqMan 探针法均可开展，按靶标特点匹配方法
针对待测序列设计引物及探针，并完成合成与预实验验证
含 RNA 提取与反转录、标准曲线制作、上机检测与数据分析
关注熔解曲线、扩增效率与复孔 Ct 一致性，保证扩增特异性
植物、血液、皮肤等 RNA 提取困难样本可评估并优化提取方案
针对待测序列设计引物及探针，评估特异性并完成合成
提取总 RNA 并检测纯度与完整性，反转录获得 cDNA
优化 PCR 体系；绝对定量时制作标准曲线并评估扩增效率
每个反应默认 3 个复孔上机扩增，采集荧光信号与 Ct 值
以 2⁻ΔΔCt 等方法计算相对表达量并完成组间统计分析
下表为本项服务的常规工作环节与说明。样品状态、数量与实验方案确认后，我们会给出明确的时间安排。
| 服务内容 | 工作说明 |
|---|---|
| 引物与 TaqMan 探针合成 | 针对待测序列设计引物及探针 |
| RNA 提取及反转录 | 提取总 RNA 并反转录为 cDNA |
| 预实验（可选） | PCR 体系优化及标准曲线制作 |
| qPCR 检测分析 | 每个反应默认 3 个复孔 |
植物、血液、皮肤等特殊样本的 RNA 提取难度较高，时间安排会相应调整，我们会在方案确认时明确说明。
| 交付内容 | 说明 |
|---|---|
| 引物与探针信息 | 引物及探针序列、合成信息与扩增片段位置 |
| 原始荧光数据 | qPCR 仪原始扩增数据、Ct 值与熔解曲线 |
| 定量分析结果 | 相对表达量（2⁻ΔΔCt）或绝对拷贝数、组间统计与图表 |
| 完整实验报告 | RNA 质检、反转录与 qPCR 条件、试剂信息与结果 |
以下为实时荧光定量 PCR 检测基因表达效果的典型结果示例。
结果呈现说明：报告提供扩增曲线、熔解曲线与相对表达量结果，并结合复孔 Ct 值与统计学检验判定组间差异。若熔解曲线出现多峰或宽峰，提示存在非特异性扩增或引物二聚体，需优化引物或反应条件。
引物与探针设计、RNA 质量与曲线判读是决定 qPCR 成败的关键，请注意以下要点：
送样要求：请提供足量且质量合格的 RNA 或 cDNA（附提取方法与质量检测结果），或提供细胞、组织等原始样本由我方提取；请同时说明靶基因、物种、转录本信息与分组方案，以便设计引物与探针。
SYBR Green 染料法通用性强、成本较低，适合常规表达定量，但需通过熔解曲线确认扩增特异性；TaqMan 探针法特异性更高、可多重检测，适合低丰度或高特异性要求的靶标，但需要合成专用探针。可根据研究目的与预算选择。
将引物跨外显子设计可减少基因组 DNA 的干扰；此外可设置无逆转录对照（-RT）与无模板对照（NTC），若 -RT 孔出现明显扩增，提示存在基因组 DNA 污染，需进一步处理 RNA 或改用跨外显子引物。
多峰或宽峰通常提示存在非特异性扩增或引物二聚体，常见原因是引物特异性不佳、退火温度偏低或体系中引物浓度过高，可优化引物设计与反应条件后重新检测。
相对定量以参考基因（内参）归一化，用 2⁻ΔΔCt 等方法比较不同样本中目标基因的表达差异；绝对定量则用已知浓度的标准品构建标准曲线，计算目标序列的拷贝数。选择哪种方式取决于研究目的。
绝对定量时，标准曲线应具备良好的线性关系，相关系数（R²）建议大于 0.99，并关注扩增效率；若 R² 偏低或效率偏离理想范围，需检查标准品梯度稀释与反应体系。
平行复孔间的 Ct 值标准差建议小于 0.5；若偏差过大，提示加样不均、存在气泡或体系不均匀，需排查操作与反应条件。
具体安排视是否需要设计合成引物与探针、是否需要 RNA 提取与预实验而定；样品与实验方案确认后，我们会给出明确的时间安排。
实时荧光定量 PCR 常与其他基因表达与调控研究手段配合。以下服务可组合开展：
service@fenghbio.com
长沙市岳麓区麓云路100号
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