蛋白免疫印迹(Western blot)

蛋白免疫印迹（Western Blot，WB）是分子生物学、生物化学与免疫遗传学中常用的蛋白质检测方法。样品经 SDS-PAGE 按分子量分离后转印至 PVDF / NC 膜，再通过特异性抗体识别目标蛋白并显色，依据条带的位置与深浅判断目标蛋白的表达情况。

丰晖生物提供一站式 Western Blot 检测服务：从蛋白提取、定量、电泳、转膜、封闭、抗体孵育到化学发光成像与灰度分析全程标准化操作，原始数据与完整报告同步交付，并附全膜带 Marker 原图，确保数据真实、客观、可追溯。

Western Blot 将凝胶电泳的分子量分离能力与抗原-抗体免疫反应的特异性有机结合。蛋白样品经 SDS 与还原剂处理后变性为线性多肽链，SDS 均匀包裹在肽链表面使其携带密集负电荷，掩盖了蛋白质原有的电荷与形状差异，仅保留分子量差异。

在聚丙烯酰胺凝胶中施加电场后，蛋白-SDS 复合物向正极迁移，凝胶的分子筛效应使分子量较小的蛋白迁移更快，从而实现依据分子量的精准分离。随后经电转印技术，在垂直电场作用下将凝胶中已分离的蛋白条带转移至 PVDF 或 NC 膜，依靠膜对蛋白质的吸附能力将其固定在膜表面。

封闭非特异性位点后，依次孵育针对目标蛋白的一抗与酶标二抗（常用 HRP 标记）；二抗识别一抗的种属来源并与之结合，形成级联放大的信号网络。最后加入化学发光底物，HRP 催化底物反应释放光子，被成像仪捕获并转换为肉眼可见的条带。

图1 蛋白免疫印迹实验原理示意图

内参蛋白与定量方式

内参蛋白用于校正上样量与转膜效率之间的差异，常用 β-actin、GAPDH、Tubulin 等。定量分析可采用灰度分析，以目标蛋白与内参条带灰度的比值反映相对表达水平，并在处理组与对照组之间进行统计学比较。

磷酸化蛋白检测要点

检测磷酸化蛋白时，应同时检测总蛋白与磷酸化位点，并全程加入磷酸酶抑制剂保护样品；封闭环节建议使用 BSA 而非脱脂奶粉，以避免酪蛋白干扰磷酸化抗体的结合。

下表为本项服务的常规工作环节与说明。样品状态、抗体与实验方案确认后，我们会给出明确的时间安排。

以下为 Raw264.7-Tlr2-Flag 过表达稳转株的 Western Blot 检测示例。

图一 过表达稳转株 Flag 标签蛋白表达检测结果

送样质量与实验细节直接决定 Western Blot 结果是否可信，请关注以下要点：

蛋白检测常需配套的细胞模型构建与表型实验。以下服务可组合开展：