Annexin V/PI 双染流式检测，精准区分活细胞、早期/晚期凋亡与坏死细胞，定量输出凋亡率数据
细胞凋亡（apoptosis）是受基因调控的程序性细胞死亡，与坏死不同，其典型特征为细胞皱缩、染色质凝集、凋亡小体形成，且不引发炎症反应。精准定量凋亡水平，是抗肿瘤药物筛选、基因功能验证与细胞毒性评价中的关键环节。
丰晖生物提供 Annexin V/PI 双染流式检测一站式服务：从样本制备、荧光染色、上机检测到数据分析全流程标准化操作，原始 FCS 数据与完整实验报告同步交付，结果稳定、可重复。
核心应用场景：
提示：凋亡率不能脱离对照组单独解读。我们会在方案阶段与您确认阴性对照、阳性对照与复孔设置，并保证报告中的总凋亡率与组间统计结果可直接用于论文与申报材料。
细胞凋亡早期，磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）由细胞膜脂质双层内侧翻转至外侧，是凋亡最早可被检测的分子事件之一。Annexin V/PI 双染法正是基于这一特征建立。
图1 Annexin V/PI 双染检测细胞凋亡原理示意图
Annexin V 是一种 Ca²⁺ 依赖性磷脂结合蛋白，在 Ca²⁺ 存在下以高亲和力结合外翻的 PS。用荧光素（常用 FITC）标记 Annexin V，即可通过荧光强度反映 PS 外翻的程度。
关键前提：染色与洗涤必须使用含 Ca²⁺ 的缓冲液（Binding Buffer）。若使用含 EDTA 的缓冲液螯合 Ca²⁺，Annexin V 将无法结合 PS，实验会整体失败。
PS 外翻并非凋亡特有：坏死细胞膜完整性丧失后，Annexin V 同样能结合膜内侧的 PS。因此必须联用碘化丙啶（PI）等膜非通透性核酸染料——凋亡早期细胞与活细胞的细胞膜完整，PI 不能进入；坏死细胞膜受损，PI 可进入细胞核与 DNA 结合并发出红色荧光。
在 Annexin V–PI 双参数散点图上：
总凋亡率 = 早期凋亡率（Q3）+ 晚期凋亡率（Q2），是报告中的核心指标。上机前需先去除碎片门与粘连体门，避免将碎片误判为凋亡细胞。
图2 流式四象限分区示意图
Annexin V/PI 双染是凋亡检测公认金标准，四象限同步区分活细胞、早期凋亡、晚期凋亡与坏死细胞
标准化流式平台，逐样本设置补偿与增益，配合单染管与未染色管校准，结果稳定可复现
只需提供细胞样本与处理信息，样本制备、荧光染色、上机检测与分析由我方全程完成
带十字门四象限图 + 关键定量数据 + 试剂与仪器信息，符合期刊发表要求
可联用 TUNEL、Caspase-3/9 活性、线粒体膜电位（JC-1）等指标，进一步定位凋亡通路
按实验方案给药或处理后收集细胞；贴壁细胞用不含 EDTA 的温和消化液消化，悬浮细胞直接收集
预冷 PBS 洗涤重悬，调整细胞密度与上样量（建议 ≥1×10⁶ 个/样本），避免细胞团聚
使用配套 Binding Buffer 体系避光孵育，严格控制孵育时间与温度
逐样本调节补偿与增益，先设碎片门与粘连体门，再采集双参数散点图
设门定量各象限比例，计算总凋亡率并进行组间统计分析，出具完整报告
下表为本项服务的常规工作环节与说明。样品状态、数量与实验方案确认后，我们会给出明确的时间安排。
| 服务内容 | 工作说明 |
|---|---|
| 样本接收与质检 | 到样当日完成细胞活率与状态确认 |
| Annexin V/PI 染色与上机检测 | 含补偿调节、单染管校准与复孔上样 |
| 数据分析与报告出具 | 四象限设门分析、定量统计与图表输出 |
如需联用 JC-1 线粒体膜电位、Caspase 活性或 TUNEL 检测，可在同一批样本上衔接完成，减少样本周转与重复准备。
| 交付内容 | 说明 |
|---|---|
| 原始流式数据文件（FCS） | 原始单细胞事件数据，可导入 FlowJo、Kaluza 等软件自行复分析 |
| 标准结果图 | 带十字门四象限散点图或密度图，直观展示各细胞群分布 |
| 关键定量分析 | 活细胞率（Q4）、早期凋亡率（Q3）、晚期凋亡/坏死率（Q2）、总凋亡率（Q2+Q3，核心指标）、碎片/损伤率（Q1） |
| 完整实验报告 | 实验步骤、试剂信息（厂家 / 货号 / 批号）、仪器参数与设门策略，符合论文发表要求 |
以下为 RLE-6TN 细胞在用药处理前后的 apoptosis 检测结果对比。
结果说明（RLE-6TN 细胞，处理前后对比）：
凋亡检测对样本状态与操作时序高度敏感，以下要点直接决定结果是否可信：
送样要求：每个样本建议提供 ≥1×10⁶ 个细胞；细胞样本请使用培养基或预冷 PBS 重悬，常温或 4 ℃ 运输，并附上处理条件（药物名称、浓度、作用时间）与分组信息。样本量有限时请提前沟通，我们会按实际情况优化上样方案。
每个样本建议提供 ≥1×10⁶ 个细胞；样本量充足时重复检测与复孔设置更灵活。若样本量有限，可提前与我们沟通，我们会按实际情况优化上样量与分组方案。
可以。若您方便，可将消化后的细胞悬液寄送；也可将贴壁细胞连同培养皿整体低温运输，由我方完成消化与染色。贴壁细胞建议使用不含 EDTA 的温和消化液，以减少机械损伤造成的假阳性。
通过 Annexin V/PI 双染的四象限分布判读：Annexin V⁺/PI⁻ 为早期凋亡，Annexin V⁺/PI⁺ 为晚期凋亡或坏死，Annexin V⁻/PI⁺ 提示膜破损的坏死细胞或碎片。必要时可联用 TUNEL、Caspase 活性检测进一步验证凋亡通路。
不建议。仅凭 PS 外翻无法区分凋亡与坏死，必须联用 PI（或 7-AAD）等膜非通透性核酸染料才能准确判读。我们默认采用双染方案。
具体周期需根据样本数量、细胞状态与排期评估确认，方案确认时我们会给出明确的时间安排；有紧急需求可提前说明，我们会协调流式机时优先安排。
包含原始 FCS 数据、四象限结果图、各象限定量数据与总凋亡率，以及完整实验报告（试剂信息、仪器参数、设门策略）。如需叠加柱状图或统计检验结果，可在委托时提出。
凋亡往往不是孤立事件。以下服务常与本项目组合开展，可统一送样、同步出报告：
service@fenghbio.com
长沙市岳麓区麓云路100号
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