CRISPR/Cas9 单双靶点 sgRNA 设计，构建敲除载体并全长测序核验
Cas9 敲除系统利用 CRISPR/Cas9 技术对细胞内目的基因位点切割，造成定点双链断裂（DSB），进而通过细胞内在修复机制（NHEJ 或 HDR）引入移码突变或片段缺失，实现该基因长期、稳定的功能缺失。CRISPR/Cas9 广泛应用于肿瘤相关基因研究、遗传疾病研究与动植物转化研究等领域。
丰晖生物提供一站式 Cas9 敲除载体构建服务，覆盖 sgRNA 设计、载体选择、构建与测序验证等环节，全流程标准化操作，原始数据与完整报告同时交付，确保数据真实可靠。
核心应用场景：
提示：单 sgRNA 移码敲除依赖 Indel 的产生，不适用于非编码基因；针对非编码基因或要求敲除效果更明确时，建议采用双 sgRNA 片段敲除策略。
CRISPR（成簇的规律间隔短回文重复序列）系统由成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白（如 Cas9）组成，是一种基因组防御机制，能够识别并切割入侵的外源 DNA，保护细胞免受病毒与噬菌体的侵害。
Cas9 蛋白是一种核酸酶，可识别并切割 DNA。向导 RNA（sgRNA）通常由 crRNA（CRISPR RNA）与 tracrRNA（trans-activating crRNA）融合而成，能引导 Cas9 蛋白定位到目标 DNA 序列。Cas9 在识别靶序列的同时，还需识别靶序列邻近的 PAM（Protospacer Adjacent Motif，前间区序列邻近基序）——PAM 是目标 DNA 上的一段短序列，是 Cas9 切割的必要条件。
Cas9 在 sgRNA 引导下识别并结合目标 DNA 的特定区域，在 PAM 序列附近切割双链，形成双链断裂（DSB）。细胞内的非同源末端连接（NHEJ）或同源重组修复（HDR）被激活以修复 DSB：NHEJ 通常导致插入或缺失（Indel），引起基因敲除或突变；HDR 在提供供体模板时，可利用模板修复 DSB，实现基因敲入或替换。
Cas9 对靶位点 DNA 双链切割产生 DSB，绝大多数情况下（>80%）细胞采用 NHEJ 修复路径，在靶位点随机产生个别碱基的删除或插入（Indel）。当 Indel 发生在编码区且碱基数非 3 的倍数时，将造成移码，得到基因敲除模型；但这种方式不适用于非编码基因的敲除。
采用两条 sgRNA 将特定的外显子片段全部删除，基因敲除效果更明确，筛选鉴定更简单，对非编码基因也有很好的敲除效果。
从 sgRNA 设计到载体选择提供全程技术沟通，协助确定敲除策略
具备成熟的分子克隆与载体构建能力，保障构建成功率
提供多种荧光报告基因与筛选抗性，便于后续挑单克隆与筛选
可构建 Cas9 与 sgRNA 同处一质粒的表达载体，或单独的 sgRNA 载体
构建完成后经测序核验，提供质粒图谱、测序文件与质控报告
针对目标基因设计 sgRNA 并评估特异性与脱靶风险
确认单 / 双靶点策略及 all-in-one 或 sgRNA 载体类型
将 sgRNA 表达盒克隆入目标敲除载体
转化感受态细胞挑取单克隆，测序核验序列
制备质粒与甘油菌并出具完整质控报告
下表为本项服务的常规工作环节与说明。靶点方案、载体类型与实验方案确认后，我们会给出明确的时间安排。
| 服务内容 | 工作说明 |
|---|---|
| sgRNA 设计与靶点评估 | 针对目标基因设计单 / 双靶点 sgRNA |
| 载体类型与元件确认 | 确定 all-in-one 或 sgRNA 载体及报告基因、筛选抗性 |
| 载体构建与转化筛选 | 克隆 sgRNA 表达盒并挑取单克隆 |
| 测序验证与报告出具 | 测序核验序列并出具质控报告 |
针对非编码基因或要求敲除效果更明确时，建议采用双 sgRNA 片段敲除策略，我们会在方案阶段一并规划。
| 交付内容 | 说明 |
|---|---|
| 液体质粒 | 默认 20μl，浓度大于 200 ng/μl，未去内毒素，不可直接转染细胞 |
| 甘油菌液 | 默认 300μl，附抗性信息，便于后续扩增与保存 |
| 质粒图谱与测序文件 | 提供敲除载体质粒图谱与测序文件，确认 sgRNA 表达盒序列 |
| 完整质控报告 | 含 sgRNA 靶点序列、载体类型、报告基因 / 筛选抗性及测序鉴定结果 |
| 技术沟通支持 | 提供售前指导，协助确定靶点策略与后续敲除实验方案 |
以下为敲除载体构建的典型结果示例。
案例说明：针对人 SENP1 基因设计 sgRNA 并构建于 pLentiCRISPR v2 GFP 敲除载体；针对人 PLA2G4A 基因设计双 sgRNA 并构建于 PX458 敲除载体，均经测序确认 sgRNA 表达盒序列正确。
敲除载体的构建质量直接影响后续敲除效率，请注意以下事项：
主要有两类：all-in-one 载体将 sgRNA 表达盒与 Cas9 表达盒置于同一质粒；sgRNA 载体只含 sgRNA 表达盒，需与表达 Cas9 的质粒搭配使用。可根据细胞类型与实验流程选择。
编码基因可用单 sgRNA 移码敲除，但该方法不适用于非编码基因；采用双 sgRNA 片段敲除可删除特定外显子片段，敲除效果更明确，对非编码基因也适用。
我们会针对目标基因设计 sgRNA 并评估其特异性与脱靶风险，同时提供备选靶点。最终敲除效果仍建议通过测序或蛋白检测在细胞层面验证。
请提供目标基因信息（基因名、转录本编号或序列）、敲除策略需求，以及所需载体类型、报告基因与筛选抗性的要求。
载体构建完成后可用于转染或病毒感染细胞开展敲除实验。默认交付的质粒未去内毒素，如需转染请下单时说明，以选择高规格质粒抽提。
具体周期与靶点方案、载体类型及测序验证情况有关。靶点与方案确认后，我们会给出明确的时间安排。
service@fenghbio.com
长沙市岳麓区麓云路100号
友情链接:
