Angiogenesis / Tube Formation Assay

血管生成

体外小管形成(tube formation)实验,评估内皮细胞成管能力,量化分支点与管腔长度

小管形成实验
内皮细胞成管
图像定量分析
多模型组合验证

血管生成(angiogenesis)是指已存在的成熟微血管通过出芽、增殖形成新生毛细血管网络的过程,区别于胚胎期由内皮祖细胞从头成血管的血管发生(vasculogenesis)。血管生成与肿瘤生长和转移、伤口愈合、缺血性疾病、炎症及视网膜病变密切相关。

体外小管形成实验(tube formation assay)是评价血管生成能力最常用的体外模型:将内皮细胞接种于基质胶上,在适宜条件下细胞可自发迁移、连接并形成三维网状管样结构,通过图像定量分析即可评价其成管能力。最常用的细胞为人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。

丰晖生物提供一站式血管生成检测服务,自有低代次细胞资源与专用培养基,配套标准化图像定量分析,原始图片与完整报告同步交付。

核心应用场景:

  • 抗血管生成药物筛选 — 评价候选化合物对成管的抑制作用,可输出 IC50
  • 肿瘤微环境研究 — 研究肿瘤细胞或其分泌物对内皮细胞成管的调控
  • 缺血性疾病研究 — 评价促血管生成因子或基因干预策略
  • 基因功能验证 — 过表达、干扰后内皮细胞成管能力的变化

提示:体外小管形成实验反映的是成管能力,不等同于体内血管生成。若需要更强的体内相关性证据,可组合委托 3D 球体出芽实验或体内基质胶栓实验,形成“体外—体内”递进验证的证据链。

将内皮细胞以适宜密度接种于已铺好基质胶的培养板中,细胞附着后启动迁移与重排:相邻细胞伸出伪足相互连接,逐步形成由细胞构成的管样网络结构,模拟了体内血管出芽与管腔形成的早期事件。

培养一定时间(通常 4–18 h)后,使用倒置显微镜采集图像,通过 ImageJ 等软件对小管网络进行定量分析,即可评价细胞的成管能力与药物干预效果。

常用定量指标

  • Branch points(分支点) — 网络中的分叉节点数量,反映网络复杂度
  • Total tube length(总管腔长度) — 所有管腔片段长度之和,最常用的核心指标
  • Loops / Meshes(闭环数) — 网络中闭合环的数量,反映成管成熟度
  • Total master segments(主干片段数) — 反映网络骨架的完整度

为什么要用低代次 HUVEC?

HUVEC 的成管能力随传代次数增加而快速下降,一般建议使用传代 7 代以内、状态良好的细胞。细胞状态不佳时会出现成管稀疏、网络断裂甚至完全不成管,导致组间无法比较。

基质胶批次与成管的关系

基质胶提供基底膜样的三维支撑,是成管发生的必要条件。不同批次基质胶的蛋白浓度差异会影响凝胶硬度与成管速度,因此同一组实验必须使用同一批号基质胶,报告中也会标明批次信息。

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自有细胞资源与专用培养基

提供低代次、高活力内皮细胞并配套专用培养基,保障成管稳定性与实验重复性

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多模型组合验证

可提供体外管形成、3D 球体出芽、体内基质胶栓等模型,形成递进式证据链

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一站式科研平台

可联动病毒构建、迁移增殖、免疫染色等配套实验,减少样本周转损耗

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标准化图像定量

采用 ImageJ 标准流程定量分支点、管腔长度与闭环数,交付规范可发表的结果

1

基质胶铺板与成胶

低温下均匀铺布基质胶,37 ℃ 孵育成胶,铺板后确认无气泡

2

细胞准备

复苏或传代低代次内皮细胞,调整至适宜密度并确认细胞活力

3

接种与处理

按方案接种细胞并加入待测药物、因子或条件培养基,同步设置对照组

4

培养与成像

37 ℃ 培养 4–18 h,在成管最佳时点用倒置显微镜采集多视野图像

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图像定量与报告

使用 ImageJ 等软件定量分支点、管腔长度与闭环数,完成统计与报告输出

下表为本项服务的常规工作环节与说明。样品状态、数量与实验方案确认后,我们会给出明确的时间安排。

服务内容工作说明
细胞准备与基质胶铺板含细胞状态确认与代次控制
接种处理与培养含成管最佳成像时点预实验
图像采集与定量分析每孔多视野采集与 ImageJ 定量
数据分析与报告出具统计检验与图表输出

如需进行抗血管生成药物的浓度梯度筛选,可输出抑制率曲线与 IC50 拟合结果。

交付内容说明
原始显微图像每孔随机多视野原始图像(含拍摄时点与物镜倍数)
图像定量数据分支点、总管腔长度、闭环数与主干片段数的逐视野原始数据
统计与图表组间比较、统计学检验结果与柱状图
完整实验报告实验步骤、细胞代次、基质胶批次与浓度、培养基配方与分组方案

以下为体外小管形成实验的典型结果示例。

图一 血管生成(小管形成)实验结果示例

结果呈现说明:成管良好的视野可见完整、连续的网状管腔结构;若处理组出现管腔断裂、分支点减少或网络稀疏,提示成管受到抑制。定量结果以分支点与总管腔长度的组间比较呈现。

1
细胞代次与状态最关键 — 用于成管的内皮细胞须传代次数少(一般 7 代以内)、活力高、形态正常。细胞状态不佳时会出现完全不成管,任何处理因素都无法体现差异。
2
整组实验使用同一批号基质胶 — 基质胶批间蛋白浓度差异会显著影响成管速度与形态,不同批号混用会导致组间不可比。
3
全程低温操作并避免气泡 — 基质胶稀释与铺板须在冰上完成,枪头与培养板预冷;铺板后检查有无气泡,气泡区域无法成管。
4
预实验确定最佳成像时点 — 一般 4 h 左右开始出现管腔、6–12 h 达到网络高峰,过快或过慢均影响判读。各组须在同一时点成像。
5
固定成像参数与视野选取方式 — 固定显微镜倍数、曝光时间与对焦方式;每孔随机选取多个视野,避免人为挑选结果较好的视野。
6
定量须采用统一参数 — 使用 ImageJ 等软件时,同一实验的全部图像须采用相同的阈值与骨架化参数,否则组间定量结果不可比。
7
注意区分成管与细胞聚集 — 细胞密集堆叠或死亡脱落后聚集形成的团块并非管腔结构,定量前需人工核查并剔除异常视野。

Q血管生成实验用什么细胞?

最常用的是人脐静脉内皮细胞(HUVEC),也可使用 HMVEC、bEnd.3 等其他内皮细胞,或稳定表达荧光蛋白的内皮细胞株。需使用低代次、高活力细胞。

Q需要多长时间出结果?

细胞铺板后通常在数小时内即可完成成管并成像,具体成像时点由预实验确定;从细胞准备到报告出具的整体安排,会在方案确认时一并给出。

Q定量指标有哪些?

常用分支点(branch points)、总管腔长度(total tube length)、闭环数(loops)与主干片段数。我们会同时提供多项指标,便于从网络复杂度与完整度两个维度评价成管水平。

Q可以评价抗血管生成药物的效果吗?

可以。支持设置浓度梯度,输出抑制率曲线与 IC50 拟合结果,适用于抗血管生成候选化合物的体外筛选。

Q体外成管结果能代表体内血管生成吗?

体外小管形成反映的是成管能力,与体内血管生成存在差异。若需更强的体内相关性证据,建议组合委托 3D 球体出芽实验或体内基质胶栓实验。

Q检测周期多长?

具体周期需结合细胞类型与成管最佳成像时点的预实验情况评估;需要开展浓度梯度筛选或多模型验证时,安排会相应放宽。方案确认时我们会给出明确的时间安排。

需要血管生成检测服务?

告知内皮细胞类型与干预条件,我们优化铺胶与观察时点,交付成管图像与分支点、管腔长度量化数据

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