细胞内活性氧检测

活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）是细胞有氧代谢过程中产生的一类高活性含氧分子与自由基，主要包括超氧阴离子（O₂·⁻）、过氧化氢（H₂O₂）、羟自由基（·OH）及单线态氧等。生理水平下 ROS 参与细胞信号转导与免疫防御；当生成与清除失衡即形成氧化应激，导致 DNA 损伤、脂质过氧化与蛋白质氧化，与肿瘤、动脉粥样硬化、神经退行性疾病、糖尿病及缺血再灌注损伤等密切相关。

常用 ROS 检测手段包括荧光探针法、电子顺磁共振（EPR/ESR）、化学发光法、分光光度法、电化学生物传感器与基因编码荧光蛋白探针等。其中 DCFH-DA 荧光探针法因操作简便、可实时成像、可流式定量，是应用最广泛的方案。

丰晖生物提供一站式细胞内 ROS 检测服务，支持荧光显微镜 / 激光共聚焦成像与流式细胞术两种读出模式，原始图像与完整报告同步交付。

DCFH-DA（2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯，2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate）本身不具荧光，可自由穿过细胞膜。进入细胞后，被胞内酯酶水解为极性的 DCFH（2′,7′-二氯二氢荧光素）；DCFH 无法自由穿膜，因而滞留在细胞内。

当细胞内存在 ROS 时，无荧光的 DCFH 被氧化为具有强绿色荧光的 DCF，其荧光强度与细胞内 ROS 水平正相关。因此可通过荧光显微镜、激光共聚焦或流式细胞仪检测绿色荧光信号，实现 ROS 水平的定性定位与定量分析。

DCF 的常用激发 / 发射波长为 488 nm / 525 nm（与 FITC 通道一致），可使用标准 FITC 滤光片或流式 FL1 通道检测。

图1 DCFH-DA 检测细胞内活性氧原理示意图

常用探针与适用场景

• DCFH-DA — 反映细胞内总体氧化水平，性价比高，应用最广
• MitoSOX Red — 特异性检测线粒体基质中的超氧阴离子，红色通道，可用于定位线粒体来源的 ROS
• Amplex Red — 与辣根过氧化物酶联用，特异性定量 H₂O₂
• DAF-FM DA — 检测一氧化氮（NO）水平
• CellROX 系列 — 氧化后与 DNA 结合发出强荧光，适合流式与成像，背景更低

为什么同一批实验必须设探针空白对照？

DCFH-DA 在光照、空气暴露或长时间放置条件下会自发氧化产生背景荧光。设置不加探针的细胞空白对照与加探针但不处理的对照，可判断信号是否来自细胞内 ROS，而非探针自发氧化或仪器背景。这是 ROS 实验数据可信的前提。

下表为本项服务的常规工作环节与说明。样品状态、数量与实验方案确认后，我们会给出明确的时间安排。

以下为细胞内活性氧检测的两种典型读出结果。

氧化应激往往与其他细胞表型变化相伴发生。以下服务常与本项目组合开展：