基因敲除作为 CRISPR‑Cas9 体系里应用最广泛的技术，为功能基因组研究、疾病模型搭建、新药研发提供了强有力的工具。今天带大家完整读懂基因敲除，搞懂敲除稳株的全套构建逻辑。
一、什么是基因敲除
简单来说，基因敲除就是利用 “分子剪刀”（如 Cas9 蛋白）精准切断目标基因的 DNA 双链。DNA 断裂之后，细胞会启动自身修复机制；修复过程中如果引入随机突变，目标基因就会丧失原有功能，最终无法合成有活性的功能蛋白，实现基因的功能失活。
二、CRISPR/Cas9 敲除核心原理
CRISPR/Cas9 原本是细菌、古细菌用来抵御外来遗传物质入侵的获得性免疫系统，1987年首次在大肠杆菌中被发现，2012 年被改造为基因编辑工具，继 ZFN、TALEN 之后，成为划时代的基因组编辑技术。
这套系统依靠 sgRNA 通过碱基互补配对，带着 Cas9 蛋白定位到基因组目标位点，剪切产生DNA 双链断裂（DSB），激活细胞两套修复通路：
1.NHEJ 非同源末端连接（敲除主要依靠这条通路） 快速把断裂 DNA 重新连接，修复速度快，但极易产生碱基插入、缺失（Indel），造成基因序列突变，破坏基因编码，以此实现基因敲除。
2.HDR 同源定向修复 需要外源同源模板参与，修复结果更精准，多用于基因定点敲入，很少用于普通基因敲除。
CRISPR/Cas9 技术原理图
三、常用的基因敲除方法
实验室常用两种敲除方案，根据基因结构和实验需求选择：
单gRNA移码敲除：只设计1条gRNA 靶向基因外显子，修复产生非 3 倍数的碱基插入缺失，阅读框移位，蛋白翻译提前终止，蛋白功能失效。
双gRNA大片段删除：设计两条gRNA，剪切位点中间包含完整/部分外显子，直接删除一大段 DNA 片段，彻底破坏基因，敲除效果稳定，不易发生回复。
左：单sgRNA移码敲除；右：双sgRNA片段敲除
想要把Cas9与gRNA送入细胞发挥作用，主流有3种递送手段：
| 质粒转染法 | 病毒感染法 | RNP电转法 |
递送效率 | 中等 | 高 | 高 |
基因组整合风险 | 有（极低） | 有（慢病毒） | 无 |
免疫原性 | 中等 | 高 | 低 |
操作难度 | 低 | 高 | 中等 |
适用场景 | 常规细胞系 | 难转染细胞、体内实验 | 常规细胞系及难转染细胞 |
💡小知识：RNP电转是现在构建敲除稳株的优选方案。体外预组装 Cas9-gRNA 核糖核蛋白复合物直接电转入细胞，不需要转录翻译，即刻起效；复合物在细胞内快速降解，作用窗口短，能显著降低脱靶风险，在干细胞、原代细胞中编辑效果优势尤为突出。
四、单克隆敲除细胞株的构建
以RNP法为例：
拿到编辑效果好的混合细胞只是第一步，科研实验往往需要基因型纯合、可稳定传代的单克隆敲除稳株，完整流程如下：
1、确定目标基因与细胞系
结合课题确定待敲除基因，提前查阅文献、数据库评估基因敲除后是否会造成细胞致死；优先挑选转染效率高、单克隆增殖能力强的细胞。
2、gRNA设计（实验成败关键）
gRNA 质量直接决定编辑效率，设计需要遵循这些要点：
① 靶向基因所有转录本共有的外显子序列；
② 靶点尽量选基因上游靠前的外显子；
③ 避开 GC 富集区，减少甲基化干扰；
④ 优先 G 碱基开头，提升转录效率；
⑤ 挑选高特异性靶点，降低脱靶风险。
实操建议：建议一次性设计 2‑3 条 gRNA，先做预实验筛选编辑效率最高的靶点。
3、gRNA合成
4、电转导入RNP复合物
Cas9蛋白和gRNA 按比例体外孵育组装成RNP复合物，和细胞悬液混合，电转仪施加脉冲让细胞膜瞬时通透，复合物进入细胞。
⚠️电转本身会造成一定细胞损伤死亡，需要摸索优化电转参数。
5、混合克隆初步验证敲除效率
电转完成培养 48-72h，收取混合细胞基因组 DNA，通过PCR+测序，确认细胞群体是否发生基因编辑，评估整体编辑效率。
6、分离单克隆，获得敲除稳株
采用有限稀释法或者流式分选获得单细胞，待单克隆细胞团长出后，提取 DNA/蛋白做PCR、测序、WB多重鉴定，筛选得到纯合敲除的单克隆稳株。
五、敲除稳株构建案例分享
📌案例 1：Hela 细胞 UBQLN4 基因纯合敲除稳株 基因水平达到100%敲除，测序验证靶点发生有效突变，完全破坏基因编码区，适合开展该基因的细胞功能学研究。
📌案例 2：Raw264.7 细胞 Prdx2 基因敲除稳株（蛋白保障型） 双靶点大片段删除策略构建，测序结合蛋白水平验证，确认目的蛋白完全不表达，获得可稳定传代的敲除细胞模型。
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