相信大家经常遇到这样的问题：用CRISPR/Cas9或碱基编辑对目的基因敲除后，测序发现敲除效率达100%，而且移码突变比例很高，但是做qPCR后显示出表达量，这是为什么呢？
您是否也遇到过这样的问题?您是怎么解决了呢?欢迎在评论区留言。
在此之前，我们需要先搞清楚一个根本问题，我们检测的是什么？
CRISPR/Cas9的敲除是通过gRNA引导Cas9蛋白在靶位点进行切割，造成DNA双链断裂（DSB），从而诱发细胞自身NHJ（非同源末端连接）或HDR修复机制，在修复过程中引入随机的碱基插入或缺失（Indel），当这些Indel不是3的倍数时，就会导致移码突变，最终导致原蛋白功能丧失。所以，敲除效率100%=基因组DNA编辑效率达到100%。
qPCR检测的是cDNA，也就是反转录后的RNA，而基因组DNA编辑效率达到100%指的是DNA，这是我们最容易忽视的一点。因此敲除验证我们检测的是基因组DNA（Sanger测序和TA克隆），所以DNA被敲≠qPCR有效。
那为什么DNA敲了，RNA还在？
原因有以下几点：
1、启动子未受到影响，DNA可以正常转录。
CRISPR通常只敲除编码区的一小段包含外显子的序列，而通常不用影响到启动子及增强子，因此DNA依旧可以正常转录产生mRNA，只是因为CRISPR造成了DNA片段的缺失或者移码突变，转录出的mRNA不能翻译出和野生型相同的蛋白。所以，我们应该明白敲除的本质是"让蛋白失活"，而不是"让RNA消失"。
2、qPCR引物跨内含子设计。
qPCR引物若设计在被切割片段的上游或下游区域，即便该外显子已被完全删除，mRNA模板上仍存在可供引物结合的序列。
3、NHEJ修复产物导致读框保留效应。
虽然CRISPR介导的DSB主要经NHEJ修复，理论上会导致indel，从而引发阅读框移位和无义介导的mRNA降解，但实际情况远比此复杂。
例如，当修复产物恰好保留了开放阅读框时，mRNA不仅可以稳定存在，甚至可能被正常翻译，这种情况下qPCR测到的不是野生型RNA，而有可能是突变后的RNA。
4、无义介导的mRNA降解没启动或效率不够
理论上，移码产生的提前终止密码子（PTC）会触发无义介导的mRNA降解（NMD），降解该部分mRNA，但NMD的效率受多种因素影响：
（1）PTC的位置：部分研究表明，如果PTC位于最后一个外显子或其下游第30–50nt范围内，NMD识别效率会比较低。
（2）细胞系差异：不同细胞系NMD活性差异巨大，某些细胞系的NMD通路本身就较弱。
（3）截短转录本的稳定性：一些被截短的mRNA由于5'UTR或3'UTR的特殊二级结构，反而比全长mRNA 稳定。
那要怎么样验证KO效果呢？最可靠的方式是单克隆筛选+测序验证。
首先，敲除后的cell pool通过有限稀释或单细胞分选获得单克隆，然后扩繁至可以提取足量的基因组DNA，通过PCR扩增目标位点，再用Sanger测序，确定每一等位基因的具体序列，最后优先选择纯合子或者嵌合子通过western blot对蛋白的表达情况进行验证。
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