在基因工程和合成生物学研究中，如何实现多个基因的高效共表达一直是科学家们关注的焦点。IRES和2A肽作为两种主流的“多基因非融合共表达”工具，凭借独特的机制在载体构建、病毒包装及转基因动物等领域大放异彩。然而，两者在表达效率、蛋白比例和后续修饰上却存在明显差异。本文将深入解析IRES与2A肽的工作原理、优缺点及选择要点，助你在实验设计中少走弯路。
一、IRES介绍
【1】什么是IRES？
IRES的全称是内部核糖体进入位点（Internal Ribosomal Entry Site），是一段位于mRNA内部的特殊核酸序列，它能够不依赖mRNA 5'端的帽子结构（m7GpppN）而直接招募核糖体启动蛋白翻译。
一般情况下，真核生物常规的蛋白翻译过程，需要核糖体先结合mRNA 5'端的帽子结构，再顺着RNA链往下“扫描”到起始密码子（AUG）启动翻译。但是如果存在一个IRES在mRNA中间的话，核糖体可以直接与其结合，然后启动下游基因的翻译，无需帽子结构参与。
IRES最初在脊髓灰质炎病毒、脑心肌炎病毒等RNA病毒中被发现。病毒入侵宿主细胞后，会“劫持”宿主核糖体，通过自身的IRES序列启动病毒蛋白翻译，而宿主细胞的帽依赖翻译会被抑制，从而让病毒快速复制。后来研究发现，部分真核细胞（如应激状态下的细胞）也存在内源性IRES，用于在特殊条件下维持关键蛋白的表达。
【2】IRES的特征
1、结构特点
无固定保守序列，但都能折叠形成复杂的二级/三级结构（如茎环、假结），这些结构是核糖体识别和结合的关键；不同来源的IRES序列长度差异较大，功能效率不同。
2、不依赖帽结构
这是IRES最核心的特性，即使mRNA 5'端帽子结构被破坏，或在抑制帽依赖翻译的环境中（如病毒感染、细胞应激），IRES仍能启动翻译，保证关键蛋白的合成。
3、部分需要辅助因子
部分IRES（尤其是病毒来源）需要细胞内的IRES结合蛋白（IBPs）辅助才能高效招募核糖体，而有些简单IRES可直接与核糖体小亚基结合，无需额外蛋白。
4、兼容性好
病毒来源的IRES（如EMCV IRES、PV IRES等）在哺乳动物细胞中兼容性最好。
【3】工作机制
1、核糖体识别结合
核糖体小亚基（40S 亚基）通过 IRES 的二级结构直接结合，或在 IBPs 辅助下与 IRES 形成复合物；
2、定位起始密码子
核糖体无需从 mRNA 5' 端 “扫描”，直接通过 IRES 结构定位到下游的起始密码子（AUG），省去扫描步骤；
3、启动翻译
核糖体大亚基（60S 亚基）与小亚基结合，形成完整核糖体，开始从起始密码子处合成蛋白质。
这个过程绕开了对 5' 帽子结构和扫描步骤的依赖，让 mRNA 能在特殊条件下高效表达，也为双基因共表达提供了可能。
【4】应用
1、双顺反子/多顺反子载体构建（最常用）
这是IRES最经典的用途,在载体中插入“启动子→基因A→IRES→基因B”的结构，转录后形成一条mRNA，能同时翻译出基因A和基因B两种蛋白。
如“目的基因+IRES+GFP”通过GFP发光标记目的蛋白是否表达、“目的基因+IRES+抗性基因”通过抗性筛选目的蛋白能稳定遗传表达的细胞。
2、应激条件下的蛋白表达
研究细胞在缺氧、氧化应激、病毒感染等条件下的蛋白表达时，可利用IRES构建载体，确保目的基因在帽依赖翻译受抑制时仍能表达，模拟生理病理状态。
二、2A肽介绍
【1】什么是2A肽？
2A肽是源于病毒（主要是小RNA病毒科）的一段短肽，长度仅18~22个氨基酸，也被称为“自我剪切”肽，具有介导核糖体的翻译跳跃的功能。简单说，当核糖体翻译到mRNA上的2A肽序列时，会跳过肽键形成的最后一步，让前后两个蛋白从同一条mRNA上“拆分”下来，实现“单转录本→双蛋白”的非融合共表达。
目前，主要有4种常用的2A肽，分别来源于口蹄疫病毒2A(F2A)、Ⅰ型猪捷申病毒2A(P2A)、明脉扁刺蛾病毒2A(T2A)、马甲型鼻炎病毒2A(E2A)，其序列分别如下：
F2A：VKQTLNFDLLKLAGCVESNPG
P2A：GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
T2A：EGRGSLLTCGDVEENPG
E2A：QCTNYALLKLAGDVESNPG
【2】2A肽的特征
1、表达量均衡
蛋白A和蛋白B的表达量几乎1:1或蛋白B表达量略小于蛋白A，尤其适合需要等量共表达的实验
2、结构紧凑
2A肽仅18~22个氨基酸，比IRES（200~1000 bp）占用载体空间小得多，适合多基因串联或空间有限的载体
3、无物种/细胞限制
在哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞甚至原核细胞中都能高效工作，兼容性比IRES更强
4、支持多基因串联
可串联多个2A肽（如基因A-2A-基因B-2A-基因C），实现一条mRNA表达3个及以上蛋白。
【3】工作机制
1、启动子驱动“基因A-2A肽-基因B”转录，形成一条mRNA；
2、核糖体结合mRNA开始翻译，先合成基因A的氨基酸序列，接着翻译2A肽；
3、当核糖体翻译到2A肽的C端时，2A肽使核糖体跳过甘氨酸(Gly)和脯氨酸(Pro)之间肽键的合成而发挥作用，提早释放已合成的蛋白A，然后继续翻译2A肽下游的基因B，最终产出两个独立的功能蛋白。
三、IRES和2A肽的优缺点
1、IRES优势在于其不影响上下游ORF的蛋白序列，不会引入额外的氨基酸。但是IRES下游ORF的表达水平比较低，同时IRES（200~1000 bp）也可能会增加载体构建和病毒包装的难度。
2、2A肽优势在于上下游ORF的蛋白表达水平相当（或者略小于）。但是2A肽可能是会在上下游ORF留下附加残基，从而可能产生不良影响，同时2A肽的自我切割并不是100％有效的，其效率会受上下游ORF序列的影响。
四、注意事项
我们在构建载体的时候，特别需要注意的是IRES前一个ORF需要添加终止密码子，2A肽前一个ORF的终止密码子需要删除。如：
【1】2个ORF情况下：
ATG+ORF1+TAA+IRES+ATG+ORF2+TAA
ATG+ORF1+P2A+ATG+ORF2+TAA
【2】3个ORF情况下：
ATG+ORF1+TAA+IRES+ATG+ORF2+P2A+ATG+ORF3+TAA
ATG+ORF1+P2A+ATG+ORF2+TAA+IRES+ATG+ORF3+TAA
