TSA荧光六标七色试剂盒
¥899.00
- 产品信息
产品简介
酪酰胺信号放大（TSA，Tyramide signal amplification）技术是一类利用辣根过氧化物酶（HRP）对靶蛋白进行标记的酶学检测方法。TSA实验原理是利用酪胺Tyramide的过氧化物酶反应（酪胺盐在HRP催化下形成共价键结合位点），产生大量的酶促产物，该产物能与周围的蛋白残基（包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基）结合，这样在抗原-抗体结合部位就有大量的荧光素沉积，使其检测信号得到10-100倍增强。
TSA多重免疫荧光是利用二抗上带有的HRP（而不是直接偶联荧光素），来催化后续添加入体系的非活性荧光素。荧光素在HRP和H₂O₂的作用下被活化，跟临近蛋白的酪氨酸残基共价偶联，使得蛋白样品与荧光素稳定结合。然后通过微波、煮沸、水浴等热修复处理，非共价结合的抗体被洗掉，共价结合的荧光素稳定结合在样本切片蛋白上。再换另一个一抗来进行第二轮孵育，周而复始。等所有抗体孵育结束，荧光素都结合好后，再检测结果。
由于每次体系中都只有单一抗体孵育，因此无需担心抗体交叉反应，以及一抗二抗种属匹配问题，大大减少了实验设计时不同种属抗体选择匹配的限制。也就是说，使用TSA技术，同一张片子上所有的靶标都可以选用特异性高的兔单克隆抗体，搭配同一支抗兔的HRP二抗就可以进行实验。本公司开发的试剂盒所使用的酪胺荧光染料可单独或配合使用，以实现单标、双标、三标及更多重荧光放大/多重同源抗体荧光标记等功能。
产品规格
100T
有效期
12个月
信号放大倍数
10-100倍
荧光染料
FH-520、FH-580、FH-690、FH-780（4种酪胺荧光染料，另需DAPI复染细胞核）
搭配二抗
Polymer-HRP 山羊抗鼠/山羊抗兔二抗（试剂盒内提供）
适用样本
石蜡切片、冰冻切片、细胞培养爬片
储存条件
荧光试剂：-20℃避光保存；二抗：-20℃保存；TSA荧光激活剂、抗体稀释液：2-8℃保存
检测方法
荧光显微镜/共聚焦显微镜/多通道荧光扫描仪/多光谱成像系统
产品特点
- 信号增强 10-100 倍 — 酪胺在HRP催化下于抗原-抗体结合部位沉积大量荧光素，显著提升检测灵敏度
- 多重标记无种属限制 — 每轮体系中仅单一抗体孵育，无需担心抗体交叉反应及一抗二抗种属匹配问题
- 同源抗体多重标记 — 同一张片子上所有靶标均可选用高特异性兔单克隆抗体，搭配同一支抗兔HRP二抗即可完成实验
- 共价稳定结合 — 活化荧光素与临近蛋白酪氨酸残基共价偶联，信号稳定、耐热修复洗脱
- 染料灵活组合 — FH系列酪胺荧光染料可单独或配合使用，灵活实现单标至六标多重荧光标记
应用范围
- 组织切片多重免疫荧光 — 适用于石蜡切片、冰冻切片的多靶标共定位与空间表达分析
- 细胞样本多重标记 — 适用于细胞爬片等样本的多重免疫荧光检测
- 同源抗体多重染色 — 多个兔源单克隆抗体在同一张片子上的多重标记实验
- 肿瘤微环境与免疫研究 — 多标志物共表达分析等科研方向
产品组分及配制
| 组分名称 | 规格（10T） | 规格（50T） | 规格（100T） | 保存条件 |
|---|---|---|---|---|
| FH-520荧光试剂 | 1mL | 5mL | 10mL | -20℃，避光保存 |
| FH-580荧光试剂 | 1mL | 5mL | 10mL | -20℃，避光保存 |
| FH-690荧光试剂 | 1mL | 5mL | 10mL | -20℃，避光保存 |
| FH-780荧光试剂 | 1mL | 5mL | 10mL | -20℃，避光保存 |
| TSA荧光激活剂 | 8µL | 40µL | 80µL | 2-8℃ |
| Polymer-HRP 山羊抗鼠二抗 | 20µL | 100µL | 200µL | -20℃ |
| Polymer-HRP 山羊抗兔二抗 | 20µL | 100µL | 200µL | -20℃ |
| 抗体稀释液 | 4mL | 20mL | 2*20mL | 2-8℃ |
| 说明书 | 1份 |
* 以下试剂建议现配现用，用多少配多少
- 荧光染料工作液配制 — 将TSA荧光激活剂与FH-XXX荧光试剂按1:500的比例充分混匀后使用
- 二抗工作液配制 — 将Polymer-HRP山羊抗鼠/兔二抗与抗体稀释液按1:200的比例充分混匀后使用
荧光光谱数据
本试剂盒相关荧光染料的荧光光谱数据如下（加粗为本试剂盒包含的染料），可根据需要进行选择：
| 荧光染料 | 激发波长/nm | 发射波长/nm |
|---|---|---|
| FH-480荧光试剂 | 440 | 480 |
| FH-520荧光试剂 | 490 | 520 |
| FH-580荧光试剂 | 550 | 580 |
| FH-620荧光试剂 | 590 | 620 |
| FH-690荧光试剂 | 630 | 690 |
| FH-780荧光试剂 | 750 | 780 |
使用方法
一、组织切片样本
- 样本准备（石蜡切片）：依次将切片放入二甲苯Ⅰ 10min - 二甲苯Ⅱ 10min - 无水乙醇Ⅰ 5min - 无水乙醇Ⅱ 5min - 95%乙醇 5min - 85%乙醇 5min - 75%乙醇5min，水洗待用。
- 样本准备（冰冻切片）：切片浸入4%多聚甲醛中固定15min，PBS洗3次，每次5min，去除多余固定液。滴加0.5% Triton X-100破膜液（用PBS配制）处理15-30min，PBS洗3次，每次5min（破膜步骤可选）。
- 阻断内源性过氧化物：切片放入3%过氧化氢溶液，室温孵育10min，以封闭内源性过氧化物酶。封闭完成后将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
- 抗原修复：组织切片置于盛满PH9.0 EDTA抗原修复液或者PH6.0柠檬酸修复缓冲液的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，依次经过中火8min，停火5min，转低火5min，此过程应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片（也可以用高压1-2min或100°C水煮15min等其他热修复方法）。自然冷却后将玻片取出，置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min（修复液和修复条件根据组织类型以及抗原类型来确定）。
- BSA封闭：切片平放于避光湿盒内，稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在圈内滴加100-200µL的5% BSA封闭液（或者与二抗同一来源血清，如山羊血清等其他封闭液）均匀覆盖组织，湿盒内加少量水防止抗体蒸发，37℃封闭30min。
- 加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加稀释好的一抗，4℃孵育过夜或者37℃孵育1-2h（4℃过夜后第二天需将切片置于37℃复温30min）。
- 加二抗：切片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗种属连接的Polymer-HRP二抗，覆盖组织，37℃孵育30min。
- 荧光染料反应：切片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片甩干，在圈内滴加50-100µL的FH-520荧光染料工作液，室温避光反应10min。标记完成后，切片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
- 重复步骤3-7进行第二轮标记（步骤5换用第二种一抗，步骤7用FH-580荧光染料工作液标记）。
- 重复步骤3-7进行第三轮标记（步骤5换用第三种一抗，步骤7用FH-690荧光染料工作液标记）。
- 重复步骤3-7进行第四轮标记（步骤5换用第四种一抗，步骤7用FH-780荧光染料工作液标记）。
- 复染细胞核：切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，室温避光孵育10min。
- 封片：切片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
- 镜检拍照：切片于荧光显微镜/共聚焦/多通道荧光扫描仪/多光谱成像系统下观察并采集图像。
二、24孔板细胞爬片样本
- 爬片准备：将细胞接种于处理过的爬片上，待其贴壁生长至合适密度（通常60%-70%融合）后，去除培养基，用预温PBS清洗3次，每次3min。
- 细胞固定：向孔板内加入4%多聚甲醛，室温固定15-30min，去除固定液，随后PBS清洗3次，每次3min。
- 细胞通透：检测核/质表达蛋白时，向孔板内加入1mL 0.5% Triton X-100（PBS配制），室温通透10-30min，PBS清洗3次，每次3min（检测膜蛋白时可以省去）。
- BSA封闭：向孔板内加入100-200µL 5%BSA（或者与二抗同一来源血清，如山羊血清等其他封闭液），37℃孵育2h。
- 加一抗：弃去封闭液，滴加100-200µL稀释好的一抗，4℃孵育过夜。
- 加二抗：PBS晃动浸洗3次，每次3min。滴加与一抗种属连接的Polymer-HRP二抗100µL，37℃孵育30min（滴加二抗时注意从玻片中心垂直滴加并且摇晃混合均匀，让试剂接触到所有细胞）。
- 荧光染料反应：PBS晃动浸洗3次，每次3min。滴加100µL的FH-520荧光染料工作液，室温避光反应20min。标记完成后，PBS晃动浸洗3次，每次3min（滴加染料时注意从玻片中心垂直滴加并且摇晃混合均匀，让试剂接触到所有细胞）。
- 抗体洗脱：滴加1mL 37℃预热至完全溶解的抗体洗脱液，37℃孵育20min，弃去洗脱液，重复2次，随后PBS浸洗3次，每次3min。
- 重复步骤4-8进行第二轮标记（步骤5换用第二种一抗，步骤7用FH-580荧光染料工作液标记）。
- 重复步骤4-8进行第三轮标记（步骤5换用第三种一抗，步骤7用FH-690荧光染料工作液标记）。
- 重复步骤4-8进行第四轮标记（步骤5换用第四种一抗，步骤7用FH-780荧光染料工作液标记）。
- 复染细胞核：滴加200µL DAPI染液，室温避光孵育10min。
- 封片：将爬片轻轻夹出，稍甩干后，用抗荧光淬灭封片剂封片。
- 镜检拍照：切片于荧光显微镜/共聚焦/多通道荧光扫描仪/多光谱成像系统下观察并采集图像。
